腸桿菌和其它非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）20E是經(jīng)典的微量生化鑒定系統，廣泛用于臨床、食品、環(huán)境及科研實(shí)驗室對腸桿菌科及部分非苛養革蘭氏陰性桿菌的表型鑒定。該系統基于20項生化反應的比色或熒光變化，通過(guò)數值編碼與數據庫比對實(shí)現菌種識別。為確保鑒定結果的準確性與可重復性，嚴格遵循標準化操作流程。
一、實(shí)驗前準備
1. 菌株要求：待測菌應為純培養、18–24小時(shí)新鮮培養物，生長(cháng)于非選擇性培養基（如血瓊脂或麥康凱平板），且為革蘭氏陰性桿菌。
2. 試劑與耗材：確認API 20E試劑條在有效期內，儲存于2–8°C；準備0.85%無(wú)菌NaCl溶液、礦物油（用于需厭氧反應的孔位）及比色卡。
3. 菌液標準化：用無(wú)菌生理鹽水或專(zhuān)用懸浮液制備菌懸液，調整至0.5 McFarland濁度標準。此濃度是保證反應靈敏度與特異性的關(guān)鍵，過(guò)高或過(guò)低均會(huì )導致假陽(yáng)性或假陰性。
二、加樣與孵育
1. 加樣操作：
使用接種針或微量移液器，將菌懸液依次注入20個(gè)微孔，每孔加滿(mǎn)，避免氣泡產(chǎn)生。
第21孔（通常為空白對照或用于后續補充試驗，不加菌液。
2. 礦物油覆蓋：
對需厭氧環(huán)境的生化反應孔，需在加樣后覆蓋1–2滴無(wú)菌礦物油（約50 μL），以隔絕氧氣，促進(jìn)脫羧酶或硫化氫反應。具體需加油孔位詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)（通常為孔1–7中的部分孔）。
3. 孵育條件：
將試劑條置于35±2°C恒溫培養箱中孵育18–24小時(shí)。不可縮短時(shí)間（反應未完成）或延長(cháng)超過(guò)24小時(shí)（可能導致非特異性反應）。
三、結果判讀與編碼
1. 顯色判讀：
孵育結束后，逐孔觀(guān)察顏色變化。多數反應通過(guò)pH指示劑顯色（如黃色=陽(yáng)性，藍色/綠色=陰性）；H?S反應通過(guò)黑色沉淀判斷；IND孔需加入1滴API IND試劑（對二甲氨基苯甲醛）后觀(guān)察紅色環(huán)（陽(yáng)性）。
2. 數值編碼：
將20項結果按3-3-3-3-3-3-2分組（共7組），每組陽(yáng)性反應賦值，相加得組值，形成7位數字編碼。
3. 數據庫比對：
通過(guò)在線(xiàn)系統或配套軟件輸入編碼，獲取鑒定結果（包括菌種名稱(chēng)、T指數/T%值）。
四、質(zhì)量控制與注意事項
避免交叉污染：每測試一株菌更換吸頭或接種環(huán)。
不可重復使用：試劑條為一次性設計，禁止部分使用或保存再用。
結果時(shí)效性：應在孵育結束后2小時(shí)內完成判讀，久置可能導致顏色褪變。
結語(yǔ)
腸桿菌和其它非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）20E作為經(jīng)典的表型鑒定工具，其操作雖看似簡(jiǎn)單，但每一步均影響鑒定準確性。只有嚴格遵循標準化流程，注重菌液濃度、孵育時(shí)間、顯色判讀等細節，并結合質(zhì)控與數據庫更新，才能充分發(fā)揮其在革蘭氏陰性桿菌鑒定中的價(jià)值。
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